Activación

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 604 (2023) Citar este artículo

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La terapia con células CAR T es un área de rápido crecimiento de tratamientos oncológicos que tiene el potencial de convertirse en atención estándar para múltiples indicaciones. Coincidentemente, la tecnología de edición de genes CRISPR/Cas está ingresando a la fabricación de productos de células CAR T de próxima generación con la promesa de una metodología de modificación celular más precisa y controlable. La intersección de estos avances médicos y moleculares crea una oportunidad para formas completamente nuevas de diseñar células modificadas para ayudar a superar las limitaciones actuales de la terapia celular. En este manuscrito presentamos datos de prueba de concepto para un circuito de retroalimentación diseñado. Fabricamos células CAR T inducibles por activación con la ayuda de la integración dirigida mediada por CRISPR. Este nuevo tipo de células T modificadas expresa el gen CAR en función de su estado de activación. Este artificio abre nuevas posibilidades para regular la función de las células CAR T tanto in vitro como in vivo. Creemos que un sistema de control fisiológico de este tipo puede ser una poderosa adición a la caja de herramientas actualmente disponible de construcciones CAR de próxima generación.

Las células T modificadas genéticamente que expresan el receptor de células T modificado (TCR) o el receptor de antígeno quimérico (CAR) son herramientas poderosas para tratar tumores malignos1. Hasta el día de hoy, se han aprobado varias terapias de células T con CAR contra trastornos hematológicos y se están evaluando muchas otras en ensayos clínicos2. Todos los productos comerciales actuales utilizan la entrega de genes basada en vectores virales3. Aunque esta es una estrategia bien establecida y relativamente segura, posee algunas limitaciones significativas. De manera mecánica, los vectores virales contemporáneos se basan en una integración semialeatoria no controlada. Aunque la seguridad de los vectores virales está demostrada por el creciente número de pacientes tratados con productos de células CAR T y las agencias de salud han aceptado la seguridad de la administración de genes virales, el riesgo inherente de mutagénesis por inserción sigue siendo un problema sin resolver4,5,6. Por lo tanto, la fabricación de células T de próxima generación tiene como objetivo utilizar métodos de edición de genes mejor controlados, como CRISPR/Cas. CRISPR/Cas permite la integración precisa de genes específicos en una ubicación predefinida dentro del genoma7. Esto, a su vez, no solo hace que el procedimiento de edición sea más preciso, sino que también abre una oportunidad para aprovechar el sitio de integración del gen.

Hasta la fecha, todos los casetes del gen CAR utilizados clínicamente están impulsados por promotores artificiales fuertes y constitutivamente activos, que anulan la regulación transcripcional dinámica que ocurre en un entorno fisiológico con un impacto directo en la cinética de activación, el fenotipo y la supervivencia8. La expresión continua de CAR puede conducir al agotamiento y a una funcionalidad subóptima de CAR in vivo9. La tecnología CRISPR/Cas permite la transferencia de genes aguas abajo de cualquier promotor endógeno, lo que reduce la necesidad de promotores modificados o externos y se centra en modificaciones celulares más fisiológicas8,10. Las regiones promotoras nativas permiten la transcripción de genes altamente regulada. Los patrones de secuencia complejos canalizan las señales reguladoras de los potenciadores distales y sus proteínas moduladoras asociadas conducen a una transcripción distinta11. Preservar la regulación genética fisiológica sofisticada puede ayudar a diseñar productos celulares diferenciados. Se ha demostrado que una mejor orientación de los CAR y los TCR modificados aporta claros beneficios a la potencia y función de los linfocitos T editados mediante la inserción de genes artificiales bajo el control de los promotores de TCR endógenos, proporcionando así una expresión génica (trans) más fisiológica12.

Además, una estrategia de edición bien diseñada puede mejorar la precisión del asesinato mediado por CAR. Las células CAR T son muy potentes en la lisis de células que expresan el antígeno diana (p. ej., CD7, CD19 o BCMA), pero no distinguen entre células sanas y anormales13,14,15. Por lo tanto, después de realizar su tarea inicial de eliminación del tumor, las células CAR T continúan atacando a todas las células que expresan su antígeno afín16. Se han propuesto varios enfoques para eludir estos efectos secundarios fuera del tumor en el objetivo de las células T con CAR persistentes. Por ejemplo, las células CAR T se pueden erradicar después de la eliminación completa del tumor mediante la administración sistémica de anticuerpos dirigidos contra un "interruptor de muerte" sintético coexpresado en las células CAR T, lo que lleva a una recuperación completa y persistente de las células B17. Otra opción es la expresión transitoria de CAR basada en ARNm, que redirige las células T contra las células diana solo mientras el ARNm se suministre sistémicamente18,19. Sin embargo, tales enfoques tienen desafíos para abordar la cinética de distribución, la precisión, la penetrancia y la persistencia de las moléculas aplicadas.

Otro método para reducir el daño al tejido sano son las células CAR T con puerta lógica20. Por ejemplo, las células CAR T dependientes de 'AND' pueden diferenciar las células tumorales del tejido sano con mayor precisión, ya que solo ejecutan la función efectora mediante el reconocimiento de antígeno dual en las células diana21. Sin embargo, la destrucción de tejido sano solo se evita de forma segura si ambos antígenos están separados espacialmente lo suficiente como para evitar el reconocimiento dual. Además, también se describieron CAR con compuerta 'NO' y 'O' en modelos preclínicos22. Estas puertas lógicas parecen ser un enfoque muy atractivo y sofisticado para regular la función de las células T editadas, pero requieren una ingeniería celular compleja y las cargas genéticas son voluminosas23.

Recientemente se describió un método más elegante en el que la activación de IL-15 mediada por CRISPR se dirigió al locus inducible de IL-1324. Los autores observaron un aumento significativo, aunque moderado, de la producción de IL-15 tras la estimulación celular, validando su concepto pero destacando la importancia de una selección adecuada del locus.

En este artículo, proponemos una expansión del enfoque específico para resolver el problema de la destrucción persistente del tejido fuera del tumor en el objetivo después de la eliminación del tumor mediante el control de la expresión del gen TCR/CAR. Nuestra estrategia tiene como objetivo reducir la carga genética necesaria y, en cambio, se basa en la regulación fisiológica de la proteína modificada. Con este fin, proponemos el uso de construcciones que se incrustan en loci de moléculas que se expresan de manera temporal y fuerte a través de cascadas de señales fisiológicas. En el caso de las células T, los loci diana aparentes están aguas abajo de los promotores que regulan al alza sus proteínas afines tras la activación de las células T (p. ej.: Nur77, FoxP3, CD69, PD-1, HLA-DR)25,26. Con este enfoque, creamos un sistema regulado temporal donde la persistencia de la estimulación de células T (exógena o endógena) es un requisito previo para ejercer la función CAR/TCR. Lo llamamos un bucle de retroalimentación diseñado: cuando las células están activas, se expresa la construcción objetivo. En este estudio, demostramos la viabilidad a través de experimentos de prueba de concepto in vitro e in vivo. Estamos convencidos de que nuestro circuito de retroalimentación diseñado puede utilizarse en aplicaciones de terapia celular avanzada.

Conceptualizamos que, en teoría, cualquier construcción puede regularse de manera similar a la regulación ascendente o descendente endógena si se dirige a un lugar apropiado y se inserta mediante recombinación homóloga. Como ejemplo de prueba de concepto, seleccionamos células T CAR anti-CD19 como un entorno disponible y relevante para la ingeniería de células T terapéuticas (Fig. 1a). En este caso, la construcción CAR se integra en el área aguas abajo de un promotor dependiente de la activación de células T, interrumpiendo simultáneamente la secuencia codificante de la proteína codificada endógenamente. Es de destacar que, para las evaluaciones previstas, el complejo TCR/CD3 se dejó sin editar, lo que permitió la clásica (re)estimulación de células T anti-CD3/CD28 que es independiente de la activación específica del antígeno anti-CD19. En nuestro ejemplo, las células T primero se estimulan policlonalmente y luego se modifican con el sistema CRISPR/Cas9, por lo que el gen CAR se integra en el locus del gen específico sustituyendo la secuencia aguas abajo con CAR (Fig. 1a). Nuestra estrategia de edición sigue los protocolos CRIPSR convencionales donde la edición ocurre 24-48 h después de la activación y está en línea con los procesos de fabricación de células CAR T de última generación (por ejemplo, procesos ultracortos) que requieren estimulación policlonal inicial. Mientras se mantenga esta activación celular inicial (especialmente en un entorno específico de antígeno), el CAR continúa expresándose creando un ciclo de retroalimentación positiva (la activación a través del reconocimiento del objetivo CAR facilita una mayor producción de proteína CAR) (Fig. 1a). Este bucle de retroalimentación diseñado debería permitir el control de la expresión de CAR por el estado de activación celular.

a Representación esquemática de la expresión de CAR bajo el control del promotor dependiente de la activación. b Cinética de expresión fisiológica de los marcadores de activación PD1, CD25, CD69, TIGIT y TIM3. El gráfico presenta la expresión del marcador a lo largo del tiempo de al menos 3 donantes. Las células se volvieron a estimular el día 6 (flecha) después de la estimulación inicial después del día 1. Las líneas de conexión representan la media. c CAR se puede incorporar con éxito en el locus PD1. Se muestra un conjunto de gráficos de puntos representativos y un histograma. Parcelas seleccionadas previamente en células CD45+ vivas individuales. d La expresión de CAR bajo el locus PD1 depende de la activación de la estimulación policlonal anti-CD3/CD28. Los gráficos muestran la expresión de CAR como unidades arbitrarias (AU) en muestras en reposo o reestimuladas de 3 experimentos independientes. Se usaron como control construcciones CAR dirigidas al locus TRAC, así como expresadas a través de integración aleatoria lentiviral (LV). Las barras de error representan la media ± SD. La significación se analizó utilizando la prueba t de Student para datos no apareados. Las células T con CAR se pueden expandir mediante estimulación específica de antígeno. El gráfico muestra la expansión del pliegue en dos rondas de estimulación específica de antígeno. Las barras de errores representan la media ± SD. f La expansión específica de antígeno conduce a un mayor contenido de células CAR T en todas las muestras, mientras que la reestimulación policlonal mejora el contenido de células CAR T solo en el entorno de expresión de CAR inducido por activación. Los gráficos muestran la expresión del marcador indicado como frecuencias en muestras en reposo o reestimuladas de 3 experimentos independientes. Se representan construcciones de CAR dirigidas al locus PD1 y expresadas a través de integración aleatoria lentiviral (LV). Las flechas indican el inicio (d0) y el final (d2) del período de estimulación. Las líneas de conexión representan la media. La significación se analizó utilizando la prueba t de Student pareada.

Para probar nuestra hipótesis, evaluamos varios marcadores bien conocidos que aumentan con la estimulación de las células T (Fig. 1b). Como criterios de selección, evaluamos la cinética de expresión, el potencial de reestimulación y la importancia biológica. Inicialmente nos enfocamos en dos marcadores clásicos de activación de células T, CD25 y CD69, pero también probamos la regulación positiva de los marcadores PD-1, TIGIT y TIM3. Estos últimos receptores no solo aumentan con la estimulación de las células T, sino que su presencia prolongada se correlaciona con el agotamiento de las células T26. Para la evaluación inicial, CD25 resultó inadecuado para nuestro enfoque, ya que su expresión se elevó incluso durante la fase de reposo (Fig. 1b). Probablemente, se excluyeron TIGIT y TIM3 porque su expresión estaba por debajo del 50% después de la estimulación (Fig. 1b). En última instancia, seleccionamos PD-1, ya que su función se caracteriza mejor y la inhibición de PD-1 es una técnica ampliamente utilizada en los tratamientos con inhibidores de puntos de control27. Teóricamente, la interrupción de PD-1 puede proporcionar beneficios para las células CAR T como se describió anteriormente28,29. Por lo tanto, para los primeros experimentos nos enfocamos en la focalización de CAR en el locus de PD-1 para establecer un modelo 2 en 1, en el que combinamos la expresión de CAR de circuito de retroalimentación diseñada con el beneficio potencial de la desactivación de PD-1 (KO) . Además, para demostrar una aplicación más amplia de nuestro concepto, también probamos la orientación del locus CD69 (Figura complementaria 1a-b). En nuestro modelo, usamos células T primarias humanas estimuladas con reactivo anti-CD3/CD28 soluble (Expamers) y usamos un sistema de administración CRISPR/Cas9 no viral y una plantilla dsDNA HDR como se describió anteriormente8. Las células T editadas expresaron fácilmente la construcción CAR, pero casi no tenían expresión residual de PD-1, lo que indica una integración dirigida exitosa, así como un KO de PD-1 muy eficiente (Fig. 1c, Fig. 2 complementaria). A continuación, estas células se dejaron sin estimular para que alcanzaran la fase de reposo o se volvieron a estimular con una dosis adicional de Expamers. 24 h después de la reestimulación, se evaluó la expresión de CAR (Fig. 1d). A la inversa de los controles (activación del gen CAR (KI) en el locus TRAC y CAR integrado aleatoriamente por transducción LV), la expresión de la construcción CAR ubicada aguas abajo del promotor PD-1 aumentó significativamente después de la reestimulación (Fig. 1d). Esta fue la primera validación experimental de que la expresión CAR del circuito de retroalimentación diseñado se puede lograr a través de nuestro enfoque. Curiosamente, la expresión de CAR en células editadas con CRISPR/Cas parece aumentar in vitro espontáneamente con el tiempo (e independientemente del estado de activación) en contraste con los receptores integrados aleatoriamente mediados por LV (Fig. 1d), lo que nuevamente apunta a la regulación negativa incompleta de PD-1 en reposo. fase en este entorno in vitro (Fig. 1b) y podría insinuar una mejor aptitud de las células T modificadas con CAR.

A continuación, decidimos probar la solidez de nuestro concepto de CAR inducible durante un período prolongado de dos rondas de estimulación específica de antígeno (Fig. 1e). Anticipamos que la estimulación específica de antígeno aumentará la frecuencia relativa de la población de células T CAR anti-CD19 dentro de las muestras, independientemente del tipo de edición utilizada. Para este propósito, expandimos las células CAR T utilizando la línea celular linfoblastoide (LCL) derivada de células B, que expresa el antígeno objetivo CD19. Después de 1 semana de cocultivo, observamos una expansión celular significativa en todas las muestras de interés, lo que indica respuestas celulares productivas específicas de antígeno. Curiosamente, el aumento de veces en la expansión celular fue mayor en las células T con CAR controladas por el promotor PD-1 en comparación con el control LV (Fig. 1e). Para examinar más a fondo el mantenimiento del comportamiento informado inicialmente de las células T CAR con circuito de retroalimentación diseñado y para mejorar la resolución celular de los ensayos, evaluamos la respuesta de las células LCL expandidas bajo reestimulación policlonal y específica de antígeno (Fig. 1f). En particular, evaluamos si la regulación positiva dinámica de los marcadores de activación de CD25 y CD69 coincide con la cinética anticipada de la expresión CAR del circuito de retroalimentación diseñado. Como era de esperar, después de la reestimulación policlonal, tanto el contenido de CD25/CD69 como el de CAR aumentaron significativamente en el día 2 posterior a la reestimulación y volvieron a los niveles iniciales en el día 6 (Fig. 1f, línea azul). Cabe destacar que solo en el grupo de células CAR T inducibles por activación, el aumento de los marcadores de activación se correlacionó con el aumento transitorio de la expresión de CAR. Esto contrastó con la reestimulación específica de antígeno, donde la activación mejorada correspondió a un mayor contenido de CAR, lo que indica la expansión de las células CAR+ en el compromiso del objetivo, independientemente de la estrategia de integración de CAR, por lo que los marcadores de activación se regulan al alza hasta el día 6 alcanzando la línea de base más tarde el día 9 después de la eliminación completa de la célula objetivo ( Fig. 1f, línea roja). Es de destacar que la disminución inicial en la frecuencia de CAR+ tras la reestimulación específica de antígeno puede atribuirse a las interacciones tempranas entre CAR+ y las células diana que conducen al impedimento estérico y al enmascaramiento del epítopo de CAR. Estos datos confirmaron que el ciclo de retroalimentación de ingeniería propuesto no disminuye con el tiempo y se convierte en una característica permanente de las celdas editadas. Es de destacar que, durante todos nuestros estudios, observamos un nivel inicial elevado de CAR (~ 40 %) (Fig. 1f) sobre la presencia de PD-1 en estado estacionario ((< 20 %) Fig. 1b). Este puede ser el resultado de la estrategia de edición y un impacto de PD-1 KO en la biología general de las células T o un artefacto del cultivo in vitro.

Después de verificar la expresión de CAR inducible por activación en experimentos prácticos, decidimos probar la funcionalidad de las células CAR T generadas y los beneficios potenciales de niveles adicionales de control. Con este fin, realizamos ensayos de destrucción tanto in vitro como in vivo (Fig. 2a, b). Para el ensayo de destrucción in vitro, preparamos células T CAR con bucle de retroalimentación diseñadas que se activaron (PD1 KO CAR KI +) o se dejaron sin estimular (PD1 KO CAR KI -) para medir su potencia citolítica (Fig. 2a). Como se anticipó, la estimulación impulsó la función destructora de las células CAR T medida como una eliminación más rápida de las células diana CD19 + HEK en comparación con el control no estimulado. Es importante destacar que este resultado se puede interpretar como un estado de activación reducido que se traducirá en una potencia reducida. Ambas observaciones están en línea con el concepto de que la función mediada por antígeno puede regularse por el estado de activación celular. Posteriormente, evaluamos la eficacia de destrucción celular en un modelo de ratón Raji de xenoinjerto (Fig. 2b). Tal como se presentó, las células CAR T producidas eliminaron eficazmente las células tumorales en unas pocas semanas de manera comparable, independientemente de la estrategia de integración de CAR. Cabe destacar que también las células T que expresan CAR bajo el promotor CD69 demostraron control tumoral, aunque menos potente que bajo PD-1 (Figura complementaria 1c-e). Estos datos muestran la capacidad no solo de PD1 KO CAR KI, sino también el enfoque general de la ingeniería genética mediada por CRISPR.

a Las células CAR T con ciclo de retroalimentación diseñado activado muestran una destrucción in vitro más rápida en comparación con la contraparte en reposo. El gráfico muestra la medición de la impedancia como una lectura de la destrucción específica de antígeno de las células diana. Células T no transducidas (control negativo), células T PD1 KO solamente (PD1 KO), células T CAR transducidas en LV (control LV), así como en reposo (PD1 KO/CAR KI -) y reestimuladas policlonalmente (PD1 KO/CAR KI + ) se usaron células T con circuito de retroalimentación modificadas por ingeniería genética. El experimento muestra puntos de datos únicos derivados de la mediana de cuadruplicados. b Los linfocitos T con circuito de retroalimentación diseñados son tan funcionales como los productos de linfocitos T con CAR de última generación en un modelo de ratón in vivo. El tumor se detectó mediante mediciones de bioluminiscencia IVIS. Se muestran imágenes de luminiscencia de un experimento representativo. La flecha indica una nueva exposición a los ratones. c Las células CAR T con circuito de retroalimentación diseñado pueden ayudar a restaurar el compartimento de células B después de la erradicación completa del tumor. El contenido de células CAR T en la sangre de cada ratón individual se calculó utilizando frecuencias celulares medidas mediante citometría de flujo. Las células se seleccionaron previamente en linfocitos vivos. El cuadro resalta las frecuencias de las células después de la reexposición de células B (d35). Ratón con carga tumoral prolongada resaltada por una estrella en b y c. Cada línea representa el ratón correspondiente. d La reexposición de células B en el día 35 conduce a un rápido aumento en el contenido de células CAR T transducidas por LV, mientras que el contenido de células CAR T del circuito de retroalimentación diseñado permanece sin cambios. Delta calculado en base a las frecuencias de células CAR T entre el día 28 (eliminación del tumor) y el día 45 (posterior a la exposición).

Basándonos en la observación in vitro de que el estado de activación puede traducirse en la potencia de las células CAR T a nivel de población, esperábamos recapitular efectos similares in vivo. Presumimos que la reexposición de ratones pocas semanas después de la eliminación del tumor debería conducir al menos a una respuesta retrasada de las células T con CAR inducidas por la activación en comparación con las contrapartes que expresan constantemente CAR (Fig. 2c, d). Con este fin, inyectamos células B primarias derivadas del mismo donante que las células T con CAR para imitar un escenario en el que las células B sanas pueden restablecerse en el torrente sanguíneo del paciente después de la remisión del tumor mediada por CAR. Aunque no pudimos detectar las células B directamente en ningún momento debido a la limitación de nuestro modelo de ratón, observamos una diferencia significativa en las poblaciones de células CAR T analizadas a lo largo del tiempo. Primero, observamos frecuencias altas bastante constantes de células CAR+ que se generaron mediante integración aleatoria incluso 5 semanas después de la inyección inicial y 3 a 4 semanas después de la extirpación del tumor (Fig. 2c). Por el contrario, el contenido de células T CAR del circuito de retroalimentación diseñado disminuyó drásticamente después de 2 semanas, lo que se correspondía con la ausencia del tumor. Solo en un animal atípico, tanto el mantenimiento de las células CAR T como la persistencia del tumor se prolongaron proporcionalmente (Fig. 2b, c). Curiosamente, tras la reexposición de células B (d35), observamos un aumento significativo en las células T CAR convencionales a la inversa de las células T CAR inducibles por activación, lo que sugiere una respuesta específica de antígeno más rápida de las células con expresión CAR constitutiva (Fig. 2d). Lo más probable es que la reacción observada se deba al contenido mucho mayor de células anteriores en el estado estacionario. Este hallazgo está en línea con nuestra hipótesis de que la presencia continua e inalterada de células CAR T en la circulación inhibirá la restauración natural de las células B. Desafortunadamente, nuestros estudios no pudieron prolongarse más allá de las 7 semanas, ya que los animales comenzaron a mostrar síntomas de GvHD y tuvieron que ser sacrificados debido a la naturaleza del xenoinjerto del modelo de ratón utilizado.

En conclusión, demostramos a través de experimentos de prueba de concepto in vitro e in vivo que la expresión de CAR bajo un promotor endógeno inducible por activación puede dar como resultado células T con CAR funcionales reguladas.

En este manuscrito, presentamos un enfoque para controlar la expresión de construcciones exógenas y, por lo tanto, obtuvimos la función de las células editadas, a través de la regulación de genes endógenos en forma de un circuito de retroalimentación diseñado. En este contexto, se introduce en el genoma un gen artificial que codifica la construcción de interés en la posición que gestiona un promotor, cuya actividad depende del estado de activación celular. En los experimentos de prueba de concepto, nos enfocamos en un escenario clínicamente relevante y utilizamos una construcción CAR para la modificación de células T. Utilizamos varios marcadores de células T dependientes de la activación clásicos significativamente regulados al alza para probar nuestra hipótesis, como CD25, CD69, TIM3, TIGIT y PD-1. En este caso, la construcción CAR se puede coexpresar (p. ej., CD69) o interrumpir el gen objetivo (p. ej., PD-1), mejorando así teóricamente la potencia antitumoral dependiendo de lo que sea más deseable. Otro enfoque de ingeniería para la expresión fisiológica de un gen artificial podría ser la integración aguas abajo de los receptores que se regulan a la baja durante el agotamiento, como el ADNM-1. Esta estrategia podría prevenir el agotamiento de las células T terminales, aumentando así la persistencia de las células T funcionales30,31. En los datos presentados, apuntamos e interrumpimos los genes PD-1 y CD69. Sin embargo, no evaluamos con suficiente extensión los beneficios informados anteriormente de la interrupción de PD-1.

En este sistema inducible por activación, pudimos demostrar que el contenido de CAR puede regularse a nivel de población por el estado de activación celular. Además, este control sigue el patrón de expresión fisiológica de las proteínas específicas y la dinámica de regulación positiva tras la estimulación indirecta (no mediada por CAR). Demostramos que este patrón se puede mantener durante al menos tres rondas de estimulación. La única divergencia detectada del estado fisiológico fue una frecuencia mucho mayor de células T CAR positivas en estado no estimulado. Esta expresión basal superior a la esperada podría explicarse por la señalización tónica a través del CAR, aunque se eligió un CAR sin agrupamiento. Se ha descrito anteriormente que la oligomerización de CAR independiente del ligando podría llevar a las células T al agotamiento32. Alternativamente, los niveles elevados de expresión en estado estacionario pueden interpretarse como artefactos de cultivo in vitro y activación inespecífica inducida por cultivo. Curiosamente, en modelos de ratones in vivo, las frecuencias de células T positivas para CAR se parecían más a la cinética de expresión natural de los marcadores de activación específicos, ya que la frecuencia de CAR disminuyó en paralelo con la erradicación del tumor y la regulación negativa fisiológica anticipada de PD-1.

El control sobre el contenido de CAR se tradujo en diferentes cualidades de la función de las poblaciones de células T tanto in vitro como in vivo. En el ensayo de destrucción in vitro, las células reestimuladas eliminaron las células que expresaban antígenos considerablemente más rápido que las células en reposo. Aunque no podemos excluir formalmente la posibilidad, no esperamos que esto sea el resultado del cambio fenotípico inducido por la reestimulación debido al corto período de tiempo entre las condiciones. Curiosamente, en el modelo de ratón Raji, observamos una correlación pronunciada entre la actividad de las células T durante la eliminación del tumor y la proporción de células T CAR positivas detectadas en la sangre. Esta correlación fue incluso visible en el nivel de un solo animal donde un ratón con una mayor persistencia de células malignas tenía niveles elevados de células CAR T durante un período prolongado. Sin embargo, en todos los ratones que recibieron las células PD1 KO CAR KI, la frecuencia CAR disminuyó sustancialmente después de la eliminación del tumor en contraste con los animales de control que recibieron células CAR T generadas por transducción lentiviral. Como consecuencia, tras la inyección de células B, los ratones de control lentiviral respondieron mucho más rápido, según lo medido por un pico significativo en el contenido de CAR. Sin embargo, debemos afirmar que nuestras mediciones se centraron en la frecuencia de las células CAR T en la sangre y no podemos excluir la migración de estas células a otros nichos del cuerpo.

Estos resultados implican una posible aplicación del circuito de retroalimentación diseñado como un mecanismo de seguridad temporal para las terapias con células CAR T. Si la incorporación del constructo se combina con la interrupción simultánea del TCR endógeno, la activación de las células T (inducida con la estimulación inicial durante la fabricación) se mantendrá exclusivamente mediante la función CAR y cesará tras el agotamiento de todas las células diana in vivo. En otras palabras, mientras las células CAR T encuentren sus células diana (p. ej., células tumorales que expresan CD19), permanecerán activas y realizarán sus funciones. Después de la eliminación de todas las células diana, la activación de las células T y la expresión de CAR asociada biológicamente disminuirán. Con el tiempo, esto hará que las células CAR T no respondan, lo que permitirá que se recuperen las poblaciones de células sanas que presentan el mismo antígeno diana (p. ej.: compartimento de células B o T sanas). Además, la falta de TCR endógeno evitará la reactivación celular. Las células T doble negativas CAR-TCR que no responden no deberían afectar la recuperación del paciente y pueden morir debido a su incapacidad para recibir señales tónicas. Sin embargo, para validar completamente esta hipótesis, es necesario realizar más estudios, como ensayos de reestimulación crónica.

Esto contrasta con la clásica integración aleatoria mediada por LV que impulsa la expresión continua de CAR en la superficie de las células T. Es más probable que dichas células CAR T respondan más rápido a una posible recaída y controlen mejor la recurrencia del tumor. Por lo tanto, no cuestionamos el potencial de las células CAR T editadas convencionalmente, sino que ofrecemos un nuevo mecanismo de edición, que se puede adaptar según la indicación del objetivo. Además, probamos nuestro concepto solo en una construcción CAR fácilmente disponible (anti-CD19). Todavía sería interesante probar nuestro diseño de CAR en diferentes circunstancias, como objetivos con densidades de antígeno más bajas (por ejemplo, HER2 o GPC2) y si esta baja densidad de antígeno tiene que ser contrarrestada por el uso de un promotor endógeno más fuerte y/o CAR de alta afinidad. diseños

Creemos que la lógica de edición propuesta también se puede explotar en otros escenarios clínicamente relevantes en los que la destrucción del tumor fuera del objetivo hace que las terapias celulares limitadas temporalmente sean deseables. El ciclo de retroalimentación de ingeniería presentado es una poderosa herramienta que combina métodos de administración de genes de última generación para refinar aún más las terapias con células T. Esperamos que nuestro trabajo inspire nuevos desarrollos en el campo de las células CAR T.

Las PBMC se aislaron de capas leucocitarias frescas mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Biocoll (Biochrom) o se seleccionaron a partir de un material de leucaféresis utilizando tecnología de selección de células T interna ATC. Las capas leucocitarias se obtuvieron de donantes de sangre masculinos o femeninos adultos autólogos en el Instituto de Anestesiología, centro cardíaco alemán de Múnich (Estado de Baviera y Universidad Técnica de Múnich). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada donante y el uso de muestras de sangre fue aprobado de acuerdo con la legislación nacional por la junta de revisión institucional local y la declaración de Helsinki y Estambul (Comité de ética de la facultad de Medicina, Universidad Técnica de Múnich: 360/13 y 55 /14). Las muestras de leucoféresis recibidas de donantes sanos se recolectaron en el CCC Cellex Collection Center Dresden bajo la cita ética (Comité ético de la Universidad Técnica de Dresden: EK309072016).

En general, las células T se enriquecieron utilizando tecnología de selección de células T interna33. Las células T aisladas se cultivaron en medio libre de suero (Thermo Fisher) en presencia o ausencia de citocinas. Las células T enriquecidas se estimularon en un punto de tiempo específico con Expamers como se describió previamente30.

Las secuencias de crRNA para gRNA fueron 5-CGTCTGGGCGGTGCTACAACGTTT-TAGAGCTATGCT-3 para PDCD1 (dirigidas a PDCD1) y 5-AGAGTCTCTCAGCTGGTACAGTTTTAGAGCTATGCT-3 para TRAC. Los RNP se prepararon de acuerdo con la recomendación de los fabricantes. Brevemente, se incubaron tracrRNA 80 µM (IDT DNA) y 80 µM crRNA (IDT DNA) a 95 °C durante 5 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Cas9 de alta fidelidad 24 µM (IDT DNA) se añadió lentamente a la solución de gRNA para producir RNP con 12 µM Cas9 y 20 µM gRNA, así como un potenciador de electroporación 20 µM (IDT DNA). Los RNP se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se usaron directamente para la electroporación.

Se usaron productos de PCR de ADN de doble cadena para electroporación y HDR (reparación dirigida por homología). El ADN del plásmido se amplificó mediante PCR de acuerdo con el siguiente protocolo de los fabricantes. Los ciclos térmicos se realizaron de la siguiente manera: 95 °C y 30 s para la desnaturalización inicial seguido de 34 ciclos de 95 °C durante 30 s, 62 °C durante 30 s, 72 °C durante 3 min y 72 °C durante 4 min como final paso de extensión. Los productos de la PCR finales se purificaron con perlas Ampure XP de acuerdo con el protocolo del fabricante (Beckman Coulter). Todas las plantillas HDR fueron valoradas. En general, la electroporación de 1 µg de ADN por 1 × 106 células produjo las mejores eficiencias de activación.

Las células T purificadas se activaron durante 48 h con Expamers y 300 UI ml-1 de IL-2 humana recombinante, 5 ng ml-1 de IL-7 humana recombinante (Peprotech) y 5 ng ml-1 de IL-15. El estímulo de Expamer se interrumpió mediante la incubación con D-biotina 1 mM (Sigma). Se sometieron a electroporación 1 × 106 células (código de pulso EH100) con ribonucleoproteína Cas9 y plantillas de ADN en 20 ul de solución Nucleofector P3 (Lonza) con una unidad 4D Nucleofector X (Lonza). Después de la electroporación, las células se cultivaron en medios sin suero con 180 UI ml-1 de IL-2 hasta el primer análisis el día 5 después de la edición. La eficiencia de KI se midió usando un anticuerpo anti-CAR específico contra el scFv introducido (Juno Therapeutics). KO se midió mediante tinción de expresión superficial de PD1 (BioLegend).

Se extrajo ADN genómico (PureLink Genomic DNA Mini Kit, Invitrogen) de células modificadas que expresan el receptor transgénico e integrado. Se realizaron PCR desde el brazo de homología 5' hasta el brazo de homología 3' para verificar la integración completa de la construcción. La PCR que amplifica la secuencia de ADN desde fuera del ADN genómico 5' en la secuencia de ADN integrada validó la inserción en los loci deseados. Los productos de PCR purificados se secuenciaron posteriormente con Sanger (Eurofins).

Para la expansión in vitro, las células T editadas se incubaron con células B transformadas por EBV (LCL) en una proporción de 1:7 (E:T) y el protocolo descrito se realizó en consecuencia33,34. La frecuencia de CAR y los números absolutos se monitorearon y midieron en los puntos de tiempo indicados de expansión.

El experimento de estimulación secuencial se realizó utilizando células T CAR modificadas y expandidas. La estimulación de Expamers se realizó como se describió previamente. La señal de estimulación se interrumpió mediante la adición de biotina 1 mM. Posteriormente, las células se lavaron y transfirieron a medios nuevos que contenían una dosis baja de IL-2 (25 UI ml−1). La expresión superficial de los marcadores de activación se controló mediante citometría de flujo (ver a continuación) y se midió el recuento de células (Nucleocounter, Chemotec).

Para el ensayo de destrucción in vitro, se utilizó el sistema xCELLigence RTCA (ACEA Biosciences Inc.). Se midió la lisis específica dirigida a células de riñón embrionario humano que expresan CD19 (HEK293-CD19+). Se sembraron 2 × 104 células diana en placa E de 96 pocillos (ACEA Biosciences Inc.) y se dejaron reposar durante la noche. Se añadieron células CAR T manipuladas en una proporción de 5:1 (E:T) y se incubaron durante el tiempo indicado. Los cambios en la señal de impedancia se midieron en tiempo real y se analizaron con RTCA Software Pro (ACEA Biosciences Inc.). Todas las líneas celulares usadas no se modificaron y se compraron de ATCC.

La citometría de flujo se realizó como se describió previamente33. Los siguientes anticuerpos se compraron de BioLegend y se usaron para el análisis. CD3 (clon OKT3-PC7), CD4 (clon OKT4-BV421), CD8 (clon RPA-T8-BV510), CD45 (clon HI30), PD1 (clon EH12.2H7-FITC y -BV421), CD69 (clon FN50- APC/Fire), CD19 (clon HIB19-BV421 y -FITC) y CD25 (clon BC96-BV605). Además, se utilizó un anticuerpo anti-idiotipo (CD19) producido internamente acoplado a APC (Bristol Myers Squibb) y yoduro de propidio (Thermo Fisher Scientific). Todas las diluciones de anticuerpos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Se compraron ratones NSG-SGM3 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmWjlTg (CMV-IL3, CSF2, KITLG) 1Eav/MloySzJ, NSGS, The Jackson Laboratory) de Jackson Laboratory (The Jackson Laboratory) y se criaron internamente en una instalación libre de patógenos en la Universidad Técnica de Munich de acuerdo con los procedimientos estándar. Se utilizaron ratones de 6 a 10 semanas de edad (machos y hembras) para los experimentos. Todos los experimentos se realizaron como se describió anteriormente y de acuerdo con las pautas de Regierung von Oberbayern. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Regierung von Oberbayern (ROB-55.2-2532.Vet_02-17-138 y Vet_02-18-162).

La nueva provocación de células B se ejecutó inyectando 10 × 106 células B compatibles con el donante 2 semanas después de la eliminación del tumor. Los experimentos con animales se ejecutaron de conformidad con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación con animales.

Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo, LLC). Los gráficos y el análisis estadístico se generaron utilizando el software GraphPad Prism (Software GraphPad).

Para todos los experimentos, el tamaño de la muestra se seleccionó en base a prácticas experimentales estándar (principalmente 3 o más experimentos independientes), a menos que el número de repeticiones fuera técnicamente desafiante, por ejemplo, estudios con ratones. La significación estadística se analizó utilizando la prueba t de Student (no) pareada. No se realizaron cálculos estadísticos del tamaño de las muestras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos generados o analizados para este estudio están disponibles en el artículo y su información complementaria. Los datos de origen detrás de los gráficos están disponibles en Datos complementarios 1. Los hallazgos descritos son propiedad de Bristol-Myers Squibb Company y parte de la información se considera un secreto comercial. Los datos sin procesar que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a través de los autores, pero pueden aplicarse restricciones a la disponibilidad de estos datos. Sin embargo, los datos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable y con el permiso de Bristol-Myers Squibb Company.

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Damos las gracias a Michaela Wagner, Eileen Benke y la Dra. Katrin Manske por su excelente apoyo técnico.

Estos autores contribuyeron por igual: Simon P. Fraessle, Claudia Tschulik y Manuel Effenberger.

Juno Therapeutics GmbH, una empresa de Bristol-Myers Squibb, Grillparzerstr. 10, 81675, Múnich, Alemania

Simon P. Fraessle, Claudia Tschulik, Manuel Effenberger, Vlad Cletiu, Maria Gerget, Lothar Germeroth, Christian Stemberger y Mateusz P. Poltorak

Instituto de Microbiología Médica, Inmunología e Higiene, Universidad Técnica de Munich, Munich, Alemania

Kilian Schober y Dirk H. Busch

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SPF, CT, ME, VC y MG contribuyeron al diseño del estudio, realizaron experimentos y analizaron los datos. KS y DHB desarrollaron y proporcionaron protocolos de ingeniería genética. CS, LG y MPP diseñaron y dirigieron el proyecto. SPF, ME y MPP compilaron el manuscrito. Todos los autores revisaron este manuscrito.

Correspondencia a Manuel Effenberger.

SPF, CT, ME, VC, MG, DHB, CS, LG y MPP son actualmente empleados de Juno Therapeutics GmbH, una empresa de Bristol-Myers Squibb y poseen acciones de Bristol-Myers Squibb. LG, CS y MPP figuran como inventores en solicitudes de patentes relacionadas presentadas anteriormente. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Mo Li y Christina Karlsson Rosenthal. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Fraessle, SP, Tschulik, C., Effenberger, M. et al. La expresión CAR inducible por activación permite un control preciso sobre la función de las células T CAR diseñadas. Commun Biol 6, 604 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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Recibido: 15 noviembre 2022

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04978-w

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